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技術(shù)文章

核酸濃度檢測(cè)(二)——讀數(shù)解讀及注意事項(xiàng)

更新日期:2017年3月24日 大字 小字

當(dāng)我們獲得了Micro Drop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果后,對(duì)光譜的正確分析至關(guān)重要。


出結(jié)果的含義

1. A260nm——核酸更高吸收峰的吸收波長(zhǎng)。

2. A280nm——蛋白更高吸收峰的吸收波長(zhǎng)。

3. A230nm——是碳水化合物更高吸收峰的吸收波長(zhǎng)。

4. A340nm——是基線校準(zhǔn)波長(zhǎng),為檢測(cè)溶液樣品的濁度和其他干擾因子。該值應(yīng)該接近0.0。如果不是,表明溶液中有懸浮物,需要純化樣品。純樣品的A340一般是0。

   A230產(chǎn)生負(fù)值主要是由于在很低 DNA 濃度的溶液中的一些其他成分的干擾所導(dǎo)致的。在下一個(gè)測(cè)定中,需要降低樣品的稀釋度,A230的負(fù)值會(huì)被校正。

   A260/A280比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估:純DNA的A260/A280比值為1.8,純 RNA的A260/A280比值為2.0。如果比值低,表示受到蛋白(芳香族)或酚類物質(zhì)的污染,需要純化樣品。

●   A260/A230比值可進(jìn)行核酸樣品純度評(píng)估:純 DNA和RNA的A260/A230比值為 1.8 – 2.2。若比值小于1.8表明樣品被碳水化合物(糖類)、鹽類或有機(jī)溶劑污染,需要純化樣品。當(dāng) 260/230<1 時(shí),通常只有兩種情況。一是胍鹽污染,二是蛋白污染。


本的不同提取方法對(duì)檢測(cè)的影響: 

●   苯酚/ Trizol萃取——?dú)埩粼噭┪廴究梢酝ㄟ^220至240nm之間的異常光譜以及260至280nm區(qū)域的偏移來表示。加氯仿離心后取上清的時(shí)候千萬不要貪多,那樣就很容易被蛋白污染。

●   純化柱提取——?dú)埩綦铱赡苡兄?30nm附近的峰值和從230nm到240nm的波谷偏移。

●   磁珠法提取——?dú)堄嘀榭赡軙?huì)導(dǎo)致光散射,并導(dǎo)致異常光譜。

操作注意事項(xiàng): 

1. A260/A280、A260/A230比值受溶液酸堿度及離子強(qiáng)度的影響,如酸溶液會(huì)使A260/A280比值降低,低離子強(qiáng)度和低 pH 溶液會(huì)增加 280 nm 處的光吸收值。因此必須確??瞻讬z測(cè)和溶解樣品所用Buffer的離子濃度和pH值一致。

2. 濃度接近2 ng/μl濃度的樣品可能會(huì)導(dǎo)致不可靠的260/280和/或260/230的比值。

3. 樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素,由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在會(huì)干擾測(cè)試效果。樣品的濃度不能過低,或者過高(超過光度計(jì)的測(cè)試范圍)。

4. 樣品混合要充分,否則吸光值太低,甚至出現(xiàn)負(fù)值;混合液不能存在氣泡,空白液無懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈。樣品混合不均勻會(huì)直接導(dǎo)致檢測(cè)不確定,重復(fù)性低。

5. 樣品檢測(cè)上樣量不能太少,必須能夠保證能后連接上下兩根光纖形成光柱,從而使得檢測(cè)正常進(jìn)行。

6. 樣品臺(tái)清潔,在檢測(cè)前,檢測(cè)后以及連續(xù)使用儀器30分鐘后均需要對(duì)上下接觸樣品的部位用雙蒸水或純水擦拭。

7. 切忌不可用噴壺在樣品臺(tái)上噴射,以防液體液體進(jìn)入儀器內(nèi)部造成損壞。

8. 切忌不可用洗滌劑或異丙醇清潔基座。

9. 儀器放置位置應(yīng)當(dāng)遠(yuǎn)離通風(fēng)口,以免液滴蒸發(fā)太快導(dǎo)致濃度讀數(shù)偏大。

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